thích vì cấu trúc kẹp tóc của hai đầu đã làm cho reporter gần với quencher khiến tất cả huỳnh quang phát từ reporter đều bị quencher hấp phụ. Nhưng nếu có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, Beacon probe sẽ bắt cặp vào trình tự đặc hiệu trên sợi đích của sản phẩm khuếch đại, nhờ vậy reporter cách xa quencher nên reporter phát được huỳnh quang khi nhận nguồn sáng kích thích. (3) Trong giai đoạn nhiệt độ kéo dài, enzyme Taq polymerase không thủy giải Beacon probe mà chỉ làm tách Beacon probe khỏi sợi đích khi sợi bổ sung được tổng hợp kéo dài đến trình tự mà probe bắt cặp vào. Cuối giai đoạn kéo dài, Beacon probe tách khỏi sợi đích và trở lại cấu trúc kẹp tóc nên không cho reporter phát được huỳnh quang nếu nhận được nguồn sáng kích thích.

Beacon probe có một số ưu điểm, đó là: (1) rất đặc hiệu vì chỉ cần trình tự sợi khuôn khác biệt là sẽ không có bắt cặp và như vậy là sẽ không có huỳnh quang –

Khi không có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, ở giai đọan nhiệt độ bắt cặp, Beacon probe sẽ không phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích vì cấu trúc chân tóc của hai đầu đã làm cho repoter gần với quencher khiến tất cả huỳnh quang phát từ reporter đều bị quencher hấp phụ.

Khi có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp, Beacon probe bắt cặp vào trình tự đặc hiệu trên sợi đích của sản phẩm khuếch đại, nhờ vậy reporter cách xa quencher nên reporter phát được huỳnh quang khi nhận nguồn sáng kích thích.

Trong giai đọan nhiệt độ kéo dài, enzyme Taq polymerase được sử dụng không thủy giải Beacon probe mà chỉ làm tách Beacon probe khỏi sợi đích khi sợi bổ sung được tổng hợp kéo dài đến trình tự mà probe bắt cặp vào.

Cuối giai đọan kéo dài, Beacon probe tách khỏi sợi đích và trở lại cấu trúch chân tóc nên không cho reporter không được hùynh quang nếu nhận được nguồn sáng kích thích

Hình 26: Tóm tắt cơ chế họat động của Beacon probe trong real-time PCR

chính nhờ vậy Beacon rất ưu việt để phát hiện SNP; (2) rất tốt để thực hiện multiplex phát hiện cùng lúc nhiều tác nhân đích. Tuy nhiên, Beacon tương đối khó thiết kế, nhất là khi thiết kế trình tự ở hai đầu 5’ và 3’ phải chú ý để có sự bắt cặp đủ mạnh làm cho probe có cấu trúc kẹp tóc mà không làm cho cấu trúc của probe tự gấp lại thành cấu hình không kẹp tóc, vì như vậy sẽ làm cho huỳnh quang của reporter phát ra tự do không mong muốn. Ngoài ra sự bắt cặp của trình tự ở hai đầu cũng không được quá mạnh để không ngăn cản probe bắt cặp vào sợi đích khi có mặt của sợi đích. Chương trình Beacon designer được cung cấp miễn phí khi mua iCycler của Biorad là một

trong các chương trình rất tốt, giúp người sử dụng dễ dàng thiết kế Beacon probe trên trình tự sợi khuôn đã nhập vào.

1. Real-time PCR sử dụng probe lai (hybridization probes)

Trong kỹ thuật này, người ta dùng 2 probe. Probe

lai 1 có đầu 3’ gắn một chất phát huỳnh quang D (donnor), và probe lai 2 có đầu 5’ gắn một chất phát huỳnh quang A (acceptor). Để tránh không cho probe lai 2 này có thể kéo dài khi nó bắt cặp lên sợi khuôn, người ta thường gắn thêm một gốc phosphate ở đầu 3’. Hai probe lai này được thiết kế sao cho khi bắt cặp trên sợi khuôn thì đầu 3’ của probe lai 1 chỉ cách đầu 5’ của probe lai 2 khoảng từ 3-5 bases, ngoài ra phải chọn D và A sao cho huỳnh quang từ D phát ra có độ dài sóng trùng với nguồn sáng kích thích của A để làm cho A phát ra được huỳnh quang có độ dài sóng khác biệt với huỳnh quang phát ra từ D. Để hệ thống hoạt động được thì thiết bị realtime phải phát được nguồn sáng kích thích D, nhưng CCD hay cảm quang phải có kính lọc để chỉ ghi nhận huỳnh quang phát ra từ A chứ không phải từ D. Cơ chế hoạt động của hybridization probes được tóm tắt như sau (hình 27): Ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp, nếu không có sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thì

Khi chưa có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, huỳnh quang phát ra từ D của probe lai 1 không kích thích được A của probe lai 2 vì chúng ở cách xa nhau

Khi có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, Probe lai 1 và probe lai 2 bắt cặp lên sợi khuôn làm cho D rất gần A nên huỳnh quang phát ra từ D (có bước sóng trùng với bước  sóng nguồn sáng kích thích của A) sẽ được A hấp phụ rồi chuyển sang phát huỳnh quang với bước sóng khác biệt với bước sóng phát huỳnh quang của D

Trong giai đoạn kéo dài, Taq polymerase vì không có hoạt tính 5’-3’ exonuclease nên sẽ tách các probe lai 1 rồi probe lai 2 khỏi sợi khuôn, do vậy là A tách rời D nên D không còn nhận được buồn sáng kích thích từ D nữa và A sẽ không còn phát huỳnh quang được.

Hình 27:

Tóm tắt cơ chế hoạt động của probe lai trong real-time PCR

D của probe lai 1 phát huỳnh quang do nhận được nguồn sáng kích thích, nhưng thiết bị real-time không ghi nhận được huỳnh quang này vì bước sóng phát ra từ D không đi qua được kính lọc để đến CCD camera hay cảm quang. Nếu có sản phẩm khuếch đại hiện diện thì probe lai 1 và probe lai 2 bắt cặp được vào sợi khuôn, do vậy mà huỳnh quang phát ra từ D sẽ là nguồn sáng kích thích A, làm cho A phát huỳnh quang và thiết bị real-time sẽ ghi nhận được huỳnh quang này nếu lượng sản phẩm khuếch đại đạt đủ ngưỡng để huỳnh quang phát ra từ A qua được kính lọc để đến được CCD camera hay cảm quang của thiết bị real-time. Cơ chế hoạt động của probe lai như vậy nên kỹ thuật này còn gọi là kỹ thuật FRET real-time (Fluorescence Resonance Energy Transfer).

Cũng như tất cả các cơ chế phát huỳnh quang khác của real-time PCR, kỹ thuật real-time PCR sử dụng các probes lai được ứng dụng để định lượng tác nhân đích có trong mẫu. Ngoài áp dụng này, real-time PCR sử dụng các probe lai còn có một ưu điểm, đó là ứng dụng để định genotype của tác nhân đích hay là định được sự khác biệt chỉ một nucleotide (SNP) của các tác nhân đích. Nguyên tắc của ứng dụng này là nhiệt độ chảy của hai probe lai trên các sơi khuôn khác biệt về trình tự dù chỉ một nucleotide cũng sẽ khác nhau, nên làm cho đường biểu diễn đỉnh chảy của chúng cũng khác nhau. Hình 28 và biểu đồ 8 là một minh họa để hiểu rõ hơn tại sao real-time PCR với probes lai có thể giúp phân biệt được các khác biệt của tác nhân đích về genotype hay thậm  chí chỉ một SNP. Để có thể thực hiện được ứng dụng này thì người làm thí nghiệm sẽ chạy thêm một chương trình phân tích melt-curve sau khi máy đã hoàn tất chương trình luân nhiệt real-time.

80^oC                                ·

81^oC                                ·

Sản phẩm khuếch đại B                 Sản phẩm khuếch đại A

Hình 28:

Minh họa cho thấy sản phẩm khuếch đại A chỉ khác B môt nucleotide nhưng nhiệt độ chảy của probe lai trên sợi khuôn đã khác biệt

78^oC        79^oC        80^oC        81^oC        82^oC            83^oC

Biểu đồ 8:

Minh họa cho thấy đỉnh nhiệt độ chảy của A phân biệt rõ với đỉnh nhiệt độ chảy của B. Nhờ vậy có thể thấy được A và B khác biệt nhau

1. Các kỹ thuật real-time PCR sử dụng probe khác

Phần trên là giới thiệu tương đối chi tiết về 3 phương pháp real-time PCR sử dụng probes làm chất phát huỳnh quang. Đây là những phương pháp thường được sử dụng trong nhiều nghiên cứu hay là trong chẩn đoán lâm sàng. Ngoài 3 phương pháp dùng probe làm chất phát huỳnh quang này, còn có nhiều phương pháp dùng probes hay cả primer nữa để làm chất phát huỳnh quang, như Eclipse probe, Amplifluor primers, Scorpion primers, Lux primers, BD-QZyme primers…Xin tham khảo tài liệu Real-time

PCR Applications Guide (http://www.gene-quantification.de/real-time-pcr-guide-bio– rad.pdf) để rõ hơn.

Các ứng dụng của real-time PCR

1.          Định lượng tác nhân đích có trong mẫu thử

Đặc trưng của real-time PCR là phát hiện sản phẩm khuếch đại trong quá trình chạy PCR khi sản phẩm khuếch đại từ DNA đích được nhân bản đạt đủ số lượng để làm cho ống phản ứng phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích. Chính nhờ đặc trưng này mà người làm thí nghiệm có thể biết được số lượng bản DNA đích ban đầu có trong ống phản ứng dựa vào sự xuất hiện huỳnh quang của ống phản ứng sớm hay muộn, tức là chu kỳ ngưỡng (Ct) của ống phản ứng nhỏ hay lớn. Có hai cách định lượng tác nhân đích dựa vào mục đích định lượng mà người làm thử nghiệm quan tâm:

1. Định lượng tuyệt đối

Người làm thử nghiệm sẽ sử dụng định lượng tuyệt đối nếu mục đích của xét nghiệm là định lượng để biết rõ số copies của tác nhân đích có trong mẫu thử hay trong bệnh phẩm. Ví dụ xét nghiệm định lượng virus viêm gan B, hay viêm gan C, hay HIV trong mẫu máu của bệnh nhân để theo dõi hiệu quả điều trị đặc hiệu. Phương pháp định lượng này đòi hỏi phải biết rõ lượng (thể tích, hay có thể là trong lượng) của mẫu thử. Để có thể thực hiện phương pháp định lượng tuyệt đối, nhà nghiên cứu hay người làm thí nghiệm phải thực hiện xét nghiệm real-time PCR của mẫu thử cùng lúc với các mẫu chuẩn đã biết trước số lượng rồi tính ra số copies DNA của tác nhân đích có trong ống

Biểu đồ 9: Biểu đồ chuẩn là một yếu tố quan trọng để làm được định lượng tuyệt đối. Nhờ biểu đồ chuẩn mà chương trình của máy có thể tính được hàm lượng DNA đích ban đầu có trong ống phản ứng.

phản ứng dựa vào đường biển diễn chuẩn (minh họa ở biểu đồ 9) xác định mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng (Ct) với số lượng copies DNA đích ban đầu có trong ống phản ứng. Cuối cùng xác định số copies tác nhân đích có trong mẫu thử hay bệnh phẩm dựa vào hệ số pha loãng mẫu và hệ số tách chiết DNA hay RNA của phương pháp chuẩn bị  mẫu trước khi thực hiện PCR.

Cụ thể phương pháp tính toán số copies của DNA đích ban đầu có trong ống phản

ứng dựa vào đường biểu diễn chuẩn như sau:

• Đường biểu diễn chuẩn cho được một hàm số biểu thị mối tương quan giữa chu kỳ ngưỡng (Y = Ct) với log₁₀ của số lượng bản DNA đích ban đầu có trong ống phản ứng (X = log₁₀ Sq). Hàm số đó là: Y = [slope (X)] + intercept, và các thông số slope và intercept đều hiển thị trên biểu đồ chuẩn.
• Từ hàm số này, người làm thí nghiệm sẽ hiểu được tại sao máy tính hiển thị được Sq, đó là nhờ tính toán từ Sq = 10^{[(Ct – intercept)/slope]}.
  1. Định lượng tương đối

Nếu muốn định lượng tác nhân đích mà người làm thí nghiệm không thể cân đo đong đếm được mẫu thử để có được số lượng chính xác thì nên làm phương pháp định lượng tương đối. Ví dụ xác định tôm sú bị nhiễm một loại virus gây bệnh nào đó nhiều hay ít; trong trường hợp này người làm thí nghiệm đâu có thể cân chính xác số lượng tôm post được nghiền để thử nghiệm do vậy mà nếu dùng phương pháp định lượng tuyệt đối sẽ gặp trở ngại vì nếu lượng tôm thử nghiệm nhiều quá thì lượng nhiễm virus dù ít vẫn có thể cho con số định lượng tuyệt đối cao và ngược lại nếu lượng tôm thử nghiệm quá ít thì con số định lượng tuyệt đối có thể thấp dù tôm nhiễm virus cao. Định lượng tương đối cũng được sử dụng trong các nghiên cứu về ung thư để định lượng một biển hiện gene nào đó, hay cũng được sử dụng trong định lượng sản phẩm biến đổi gene. Các ví dụ minh họa trong các phương pháp định lượng tương đối sau đây sẽ làm rõ hơn về định lượng tương đối.

Định lượng tương đối dựa trên đơn vi khối lượng (unit mass)

Phương pháp định lượng này có thể áp dụng trong định lượng biểu hiện gene với lượng mẫu thử nghiệm phải được xác định chính xác (lượng tế bào, lượng nucleic acid tách chiết từ mẫu…). Lấy ví dụ định lượng biểu hiện gene P53 trên cấy tế bào có thử

chất nghiên cứu X gây ung thư so với cấy tế bào chứng không thử chất nghiên cứu X. Nhà nghiên cứu thực hiện hai lô cấy tế bào cùng ngày tuổi, sau đó một lô thử thêm chất X, một lô chứng không thử chất X. Sau đó lấy cùng một lượng tế bào của cả hai lô để tách chiết và định lượng RNA toàn bộ của cả hai lô. Lấy cùng một lượng RNA tách chiết được của cả hai lô (ví dụ 50 ng cho mỗi lô), thực hiện thử nghiệm RT real-time PCR với mồi đặc hiệu mRNA của P53. Xác định Ct của mRNA của P53 với giá trị Ct[T] là chu kỳ ngưỡng của khuếch đại mRNA của P53 trên 50 ng RNA tách chiết từ lô tế bào có thử chất X và Ct[C] là chu kỳ ngưỡng của khuếch đại mRNA của P53 trên 50 ng RNA tách chiết từ lô tế bào chứng không có thử chất X. Nếu hiệu quả PCR là đạt 100 %, nghĩa là cứ sau mỗi chu kỳ nhiệt lượng DNA luôn tăng gấp đôi (E = 2) thì tỷ lệ biểu hiện gene P53 của lô tế bào có thử chất X so với lô chứng sẽ là:

Tỷ lệ biểu hiện gene P53 [Thử/Chứng] = 2^{(Ct[C]-Ct[T])}

Ví dụ, nếu Ct[T] là 12, Ct[C] là 15, thì tỷ lệ biểu hiện gene P53 của tế bào có thử chất X so với tế bào không thử chất X là 2^(15-12) = 2³ = 8. Có nghĩa là chất X đã làm cho biểu hiện P53 trên tế bào tăng gấp 8 lần so với chứng.

Định lượng tương đối dựa trên gene tham chiếu (reference gene)

Phương pháp định lượng này có thể áp dụng trong định lượng tác nhân gây bệnh trong các mẫu thử mà không thể xác định chính xác số lượng, hay là định lượng biểu hiện gene trong các mô ung thư. Có thể áp dụng một trong các phương pháp sau đây:

Phương pháp 2^–DDCt của Livak

Phương pháp này có thể dùng để nghiên cứu biểu hiện một gene trong mẫu cấy tế bào ung thư, so với mẫu cấy tế bào bình thường; hay cũng có thể nghiên cứu biểu hiện một gene nào đó trên cấy tế bào có thử chất gây ung thư X so với cấy tế bào không thử X như ví dụ trên. Trong phương pháp này, người làm thí nghiệm sẽ định lượng không chỉ gene cần nghiên cứu (Target = Tg) mà cả một gene tham chiếu (reference = Ref) tức là gene mà các nghiên cứu trước đó đã xác định là có biểu hiện như nhau giữa hai mẫu tế bào (Thử: tế bào ung thư hay có thử chất X, gọi là mẫu T; và Chứng: tế bào không ung thư hay không thử chất X, gọi là mẫu C). Như vậy ứng với mẫu T và mẫu C sẽ có các kết quả định lượng cho cả gene Tg và gene Ref qua các thông số:

• Ct(T/Tg): là chu kỳ ngưỡng của gene đích (Tg) trong mẫu thử (T),
• Ct(T/Ref): là chu kỳ ngưỡng của gene tham chiếu (Ref) trong mẫu thử (T),
• Ct(C/Tg): là chu kỳ ngưỡng của gene đích (Tg) trong mẫu chứng (C), và
• Ct(C/Ref): là chu kỳ ngưỡng của gene tham chiếu (Ref) trong mẫu chứng (C).

Dựa trên các thông số này, chúng ta sẽ thường hóa (normalized) chu kỳ ngưỡng của gene đích trên mẫu thử (T) và mẫu chứng (C) bằng cách tính hiệu số chênh lệch Ct của gene đích với gene tham chiểu trên các mẫu:

Sau đó sẽ thường hóa DCt mẫu thử bằng hiệu số chênh lệch DCt(T) với DCt(C)

DDCt               =          DCt(T) –  DCt(C)

Từ đó tính ra tỷ lệ biểu hiện của gene đích trên mẫu thử so với mẫu chứng, nếu hiệu quả PCR của cả hai đều đạt 100%, là R = 2^–DDCt

Ví dụ sau đây minh họa cho phương pháp 2^DDCt của Livak áp dụng trong nghiên cứu biểu hiện gene P53 trên cấy tế bào buồng trứng ung thư (T) so với tế bào buồng trứng bình thường (C). Cả hai đều được tách chiết RNA toàn bộ rồi lấy 50 ng RNA được tách chiết để làm thử nghiệm RT real-time PCR với 2 Taqman probe và mồi đặc hiệu cho mRNA của P53 và của gene tham chiếu là GAPDH (các nghiên cứu trước đó chứng minh là GAPDH biểu hiện không khác biệt trên mô bình thường và mô ung thư). Kết quả trình bày trong bảng 8 dưới đây:

Bảng 8: Chu kỳ ngưỡng của gene P53 (Tg) và GADPH (Ref) của hai mẫu cấy tế bào buồng trứng ung thư (T) và bình thường (C).

Với các kết quả trình bày trong bảng 8 này, chúng ta sẽ tính được

DCt(T)                        =          Ct(T/Tg) – Ct(T/Ref)                        =          12.0   – 15.9

=          -3.9

DCt(C)                        =          Ct(C/Tg) – Ct(C/Ref)                       =          15.0   – 16.5

=          -1.5

DDCt               =          DCt(T) –  DCt(C)                   =          -3.9 – (-1.5)  =          -2.4

Từ đó tính ra tỷ lệ biểu hiện của P53 trên mẫu thử so với mẫu chứng, nếu hiệu quả PCR của cả hai đều đạt 100%, là R = 2^-(-2.4) = 5.3

Có nghĩa là P53 ở tế bào ung thư biểu hiện gấp 5.3 lần ở tế bào bình thường.

Phương pháp Pfaffl

Phương pháp 2^DDCt của Livak áp dụng trên real-time PCR mà hiệu quả PCR của cả hai gene đích và tham chiếu đều đạt 100% tức là E = 2. Nếu hiệu quả PCR của hai  gene khác nhau, gene đích (Tg) là E(Tg), và gene tham chiếu (Ref) là E(Ref) thì chúng ta phải sử dụng một cách tính tổng quát hơn của phương pháp Pfaffl để tính tỷ lệ (R) biểu hiện của gene đích trên mẫu thử so với mẫu chứng:

Công thức này thật ra chỉ là dạng tổng quát của công thức Livak, vì nếu cả hai gene đều có hiệu quả PCR 100%, tức E = 2, thì công thức trên sẽ là:

R         =          2DCt(C/Tg-T/Tg)/2DCt(C/Ref-T/Ref)    =          2DCt(C/Tg-T/Tg) – DCt(C/Ref-T/Ref)

=          2-[DCt(T/Tg-C/Tg)] – [DCt(T/Ref-C/Ref)]               =          2-DDCt

Minh họa bằng cách áp dụng vào ví dụ trên, nếu cả hai gene đều có hiệu quả PCR là 100% (E = 2) thì công thức trên sẽ được tính là:

R         =          215-12/216.5-15.9

=          2³/2^0.6             =       8/1.52    =          5.3

Định lượng tương đối dựa trên khối lượng vật chủ

Để có thể định lượng được tỷ lệ nhiễm tác nhân virus gây bệnh trên tôm nhiều hay ít thì phải xác định được lượng mẫu được thử nghiệm. Do vậy cần phải có hai hệ thống, một là hệ thống thử để định lượng được tác nhân virus gây bệnh có trong mẫu thử, và một là hệ thống tham chiếu định lượng được lượng mẫu đưa vào thử nghiệm. Với phương pháp real-time PCR thì thông số định lượng sẽ có được chính là  chu kỳ  ngưỡng (Ct), và tỷ lệ nhiễm tác nhân virus gây bệnh sẽ chính là tỷ lệ % Ct của đường biểu diễn khuếch đại của một đọan gene đặc hiệu tác nhân đích (gọi là Ct[T]) so với Ct của đường biểu diễn khuếch đại của một đọan gene giữ nhà hiện diện trong bộ gene vật chủ (gọi là Ct[R]). Chúng tôi đặt tên tỷ lệ này là IP (Infected pathogen).

Đối với hệ thống thử thì nguyên tắc của kỹ thuật real-time PCR là khuếch đại và

đồng thời phát hiện một đọan DNA đặc hiệu từ bộ gene của tác nhân virus gây bệnh

nhờ sử dụng một cặp mồi đặc hiệu và một Taqman probe đặc hiệu có gắn chất phát hùynh quang FAM ở đầu 5’ và chất hấp phụ hùynh quang ở đầu 3’. Trong khi chạy PCR, một khi có sản phẩm khuếch đại đặc hiệu xuất hiện trong ống PCR thì taqman probe đặc hiệu với trình tự đích sẽ bắt cặp vào sản phẩm khuếch đại và sẽ bị thủy giải bởi men taq polymerase (nhờ hoạt tính 5’- 3’ exonuclease) khi tổng hợp sợi bổ sung ở giai đọan kéo dài. Sự thủy giải taqman probe sẽ làm tách rời chất phát hùynh quang FAM ở đầu 5’ khỏi chất hấp phụ hùynh quang (quencher) ở đầu 3’ của probe, nhờ vậy ống phản ứng sẽ phát hùynh quang khi nhận được ánh sánh kích thích, và sự phát hùynh quang này sẽ được ghi nhận bởi đầu đọc real-time của máy. Mẫu thử chứa nhiều bản đích ban đầu sẽ có chu kỳ ngưỡng (Ct = chu kỳ mà đầu đọc realtime của máy bắt đầu ghi nhận được có tín hiệu hùynh quang trong ống phản ứng) phát hiện sớm hơn là mẫu thử có ít bản đích. Đối với hệ thống chỉ thị thì cũng tương tự như vậy nhưng mồi và Taqman probe thì sẽ được thiết kế để đặc hiệu cho một gene giữ nhà hiện diện trong bộ gene của vật chủ. Ở đây, để tránh sự cạnh tranh lẫn nhau giữa hai hệ thống thử và tham chiếu làm cho sự định lượng không chính xác, chúng tôi thiết kế hai hệ thống này trong hai ống phản ứng khác nhau, do vậy mà Taqman probe của hệ thống tham chiếu cũng sẽ sử dụng cùng màu phát hùynh quang FAM ở đầu 5’ giống như Taqman probe của hệ thống thử.

Ví dụ định lượng virus gây đỏ mang (GAV, Gill associated virus) nhiễm trong mẫu tôm bằng bộ thử nghiệm RT qPCR phát hiện và định lượng GAV do công ty Nam Khoa sản xuất. Nguyên tắc của bộ thử nghiệm này, là định lượng GAV đồng thời với định lượng gene tham chiếu là cytochrome b của tôm có trong mẫu để xác định được tỷ lệ tôm nhiễm bệnh. Phương pháp thực hiện là:

• Trước hết lấy một lượng tôm thử nghiệm không cần chính xác số lượng, thực hiện tách chiết RNA tòan phần rồi đưa vào tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên;
• Sau đó thực hiện real-time PCR sử dụng Taqman probe và mồi đặc hiệu tương ứng cho GAV và cho gene cytochrome b. Kết quả sẽ cho chúng ta Ct[GAV] của GAV và Ct[Cytob] của gene cytochrome b. Tỷ lệ Ct[GAV]/Ct[Cytob] cho biết tỷ lệ nhiễm GAV trên mẫu tôm.

2.          Xác định tỷ lệ biến đổi gene (GMO, Gene Modified Organism) có trong mẫu

Lợi điểm chính yếu của sinh vật biến đổi gene chính là làm tăng giá trị dinh dưỡng và/hay kháng lại sâu bệnh hay thuốc diệt cỏ. Đậu, bắp, lúa mì, lúa và bông là các cây lương thực thường được biến đổi gene nhất. Tuy có lợi điểm nhưng mức độ an tòan vẫn chưa được biết rõ nên nhiều quốc gia đòi hỏi kiểm soát tỷ lệ biến đổi gene của sinh vật và sản phẩm của nó, và chính do vậy mà cần phải có các phương pháp chính xác và nhạy cảm để làm được việc này. Các phương pháp hiện nay đang được sử dụng là ELISA và PCR. ELISA tương đối rẽ và nhanh, nhưng phương pháp PCR có lợi điểm là nhạy cảm, và có thể định lượng được. Cơ sở của PCR là định lượng một promoter thường có trong vector để biểu hiện được gene đã chèn vào vector này sau khi chuyển gene vào sinh vật đích. Ví dụ đậu biến đổi gene để kháng được thuốc trừ cỏ là do nhận được gene giúp phục hồi một đường biến dưỡng acid amin thiết yếu vốn dĩ bị glyphosate phá hủy. Đây chính là gene enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (epsps) được cô lập từ vi khuẩn có ở đất, đó là Agrobacterium sp. dòng cp4. Gene này được chèn vào vector là virus khảm súp-lơ (cauliflower mosaic virus, CaMV) có mang promoter 35S rồi chuyển vào cây đậu. Vector có mang promoter 35S này rất thường được dùng để chuyển gene trong thực vật là vì phổ chuyển gene và biểu hiện được  gene rất rộng cho nhiều lọai cây. Ngoài ra promoter 35S có trình tự rất ổn định và được biết rõ. Chính vì vậy nên CaMV 35S promoter là đối tượng chính yếu dùng để định tính và định lượng tỷ lệ biến đổi gene trong các sinh vật hay sản phẩm biến đổi gene. Sau đây là một ví dụ định lượng tỷ lệ biến đổi gene trong đậu nành để minh họa.

Để thực hiện được thử nghiệm, trước hết phải có các mẫu chuẩn tức là mẫu đậu nành đã có trộn thêm đậu nành biến đổi gene theo tỷ lệ biết trước từ 0% đến 5% (mua từ Sigma). Gene đích để định lượng là promoter 35S, gene tham chiếu là gene lectin của đậu nành. Các mẫu chuẩn và mẫu thử đểu được tách chiết DNA (dùng bộ tách  chiết DNA cho thực vật, như bộ DNeasy plant mini kit của Qiagen có thể tách chiết được 1-2mg từ 55-100mg sản phẩm). Thực hiện real-time PCR (sử dụng SYBR hay Taqman probe) định lượng hai gene trên một lượng nhất định DNA tách chiết được từ các mẫu thử và mẫu chuẩn. Kết quả Ct được ghi nhận và trình bày trong bảng 9. Biểu đồ 10 trình bày mối quan hệ tuyến tính giữa tỷ lệ GMO% và DCt.

Bảng 9: Chu kỳ ngưỡng của S35 và lectin của các mẫu chuẩn và của các mẫu thử

log(GMO%)

Biểu đồ 10: Biểu đồ chuẩn mối quan hệ giữa DCt  và tỷ lệ GMO

Từ hàm số tương quan y = -0.295x + 1.592 với y là log(GMO%) và x là DCt, chúng ta sẽ tính được mẫu 1 với DCt là 05.37 thì tỷ lệ GMO% là 7.9%, còn của mẫu 2 là 0-0.1%.

3.          Phát hiện khác biệt SNP và xác định kiểu di truyền

Sản phẩm khuếch đại của các trình tự đích có thể khác biệt chỉ một nucleotide, gọi là SNP, hay là có thể khác biệt một số nucleotide của một trình tự. Phát hiện các khác biệt này nhiều lúc rất có ý nghĩa, chẳn hạn phát hiện đột biến kháng thuốc là phát hiện các SNP, hay phân biệt các kiểu di truyền của các tác nhân đích có trong mẫu thử là các bệnh phẩm lấy từ bệnh nhân là phát hiện các trình tự khác biệt. Real-time PCR hoàn toàn có thể ứng dụng để phát hiện khác biệt SNP và xác định kiểu di truyền.

Với real-time PCR dùng màu huỳnh quang chèn làm chất phát huỳnh quang thì phải sử dụng màu HRM và phải thực hiện chương trình phân tích HRM sau khi hoàn tất chương trình luân nhiệt thì mới có thể phát hiện được khác biệt SNP và xác định được kiểu di truyền (xem phần kỹ thuật phân tích phân giải cao nhiệt độ chảy).

Với real-time PCR dùng probe làm chất phát huỳnh quang thì tùy sự tiện lợi hay quen thuộc với kỹ thuật nào mà nhà nghiên cứu hay người làm thí nghiệm có thể chọn phương pháp thích hợp với mình. Ví dụ với Taqman probe, để phát hiện sự khác biệt SNP và định genotype, nhà nghiên cứu phải thiết kế các Taqman probe (mang các chất phát huỳnh quang R khác nhau) bắt cặp trên cùng vị trí của sản phẩm khuếch đại  nhưng các probe này có sự khác biệt về trình tự tương ứng với sự khác biệt SNP hay khác biệt trình tự giúp phân biệt genotype. Trong giai đoạn bắt cặp thì probe có trình tự

tương thích nhất với trình tự đích trên sản phẩm khuếch đại sẽ bắt cặp lên sợi đích và sẽ bị Taq polymerase thủy giải, do vậy đường biểu diễn khuếch đại tương ứng với màu huỳnh quang của probe sẽ ngóc lên và đến cực đại trong khi tín hiệu của các màu huỳnh quang khác sẽ vẫn nằm dưới huỳnh quang nền vì các probe tương ứng vẫn còn nguyên vẹn và không bị thủy giải. Hình 29 dưới đây minh họa cơ chế hoạt động của Taqman probe trong phát hiện SNP hay genotype.

Hình 29: Minh họa cơ chế họat động của Taqman probe trong phát hiện khác biệt  SNP hay genotype  với probe R1 cho wild type và probe R2 cho kiểu đột biến. Hình trên chỉ có wild type. Hình  giữa chỉ có đột biến, và hình dưới là heterozygote vừa wild type, vừa đột biến

Phương pháp real-time PCR dùng probe lai (FRET) cũng được các nhà nghiên cứu sử dụng để phát hiện các khác biệt SNP và đặc biệt là khác biệt genotype. Phương pháp này tỏ ra ưu điểm hơn phương pháp sử dụng Taqman probe trong phát hiện các khác biệt genotype, nhất là khi các genotype của tác nhân đích ngoài khác biệt nhau về trình tự đặc trưng còn chứa các khác biệt trình tự do sự khác biệt dòng hay khác biệt vì đột biến trong quá trình phát triển (ví dụ HIV, HCV, HBV…). Lý do là rất khó thiết kế được Taqman probe đặc hiệu cho một genotype vì ngoài trình tự đặc hiệu cho genotype Taqman probe sẽ phải chứa các trình tự bắt cặp với các trình tự biến đổi và chính điều này sẽ làm cho hiệu quả bắt cặp của Taqman probe đặc hiệu cho genotype sẽ không cao, do vậy kết quả phát hiện genotype sẽ không đặc hiệu như mong muốn. Trong khi đó thiết kế probe lai sẽ dễ dàng hơn, chỉ cần quan tâm đến trình tự khác biệt cho genotype mà không nhất thiết phải quan tâm đến các biến đổi trình tự khác, vì cho dù có mang các trình tự biến đổi ngoài trình tự đặc hiệu genotype thì khi phân tích đỉnh chảy bằng chương trình HRM thì mỗi genotype sẽ biểu hiện một đỉnh chảy đặc trưng phụ thuộc chủ yếu vào trình tự đặc hiệu của genotype mà hai probe lai bắt cặp vào (xem phần probe lai). Biểu đồ 11 là một ví dụ của ứng dụng probe lai trong phát hiện genotype của HCV bằng real-time PCR đặc hiệu vùng 5’-NC.

Biểu đồ 11: Kiểu đỉnh chảy tương ứng với genotype HCV trong kết quả phân tích đỉnh chảy sản phẩm khuếch đại của real-time đặc hiệu vùng 5’NC và dùng FRET probe (trích từ Clinical Chemistry 48:12)